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活細胞內(nèi)蛋白穩(wěn)定性實時監(jiān)測:基于內(nèi)含肽生物傳感器的高通量分析新范式

更新時間:2025-06-24      點擊次數(shù):162
  蛋白質(zhì)穩(wěn)定性是影響其功能、折疊和降解的關鍵因素,在活細胞內(nèi)直接測量蛋白穩(wěn)定性一直是實驗研究中的難題。傳統(tǒng)方法往往操作復雜、耗時長,且難以在活細胞中獲得定量結(jié)果?;趦?nèi)含肽(Intein)的生物傳感器為解決這一問題提供了新思路。
 
  內(nèi)含肽生物傳感器的原理
 
  內(nèi)含肽是一類存在于宿主蛋白中的可自剪接多肽序列,可通過自催化蛋白剪接反應將自身切除,并將兩端外顯肽重新連接形成成熟蛋白。由于其對肽鍵的精準重排能力,內(nèi)含肽已廣泛應用于蛋白質(zhì)工程。部分微生物中的內(nèi)含肽還可感應金屬、熱、氧化應激等環(huán)境刺激,作為調(diào)控蛋白功能的傳感元件?;诖耍芯空唛_發(fā)了多種剪接依賴型報告系統(tǒng),用于篩選剪接抑制劑或構(gòu)建生物傳感器。
 
  內(nèi)含肽生物傳感器在蛋白穩(wěn)定性監(jiān)測中的應用
 
  2025年,美國莫瑞州立大學Christopher W. Lennon團隊開發(fā)了一種基于內(nèi)含肽的生物傳感器,用于活細胞內(nèi)蛋白穩(wěn)定性的實時監(jiān)測。該方法的核心是將目標蛋白插入內(nèi)含肽內(nèi)部,而非直接融合于報告蛋白,有效避免了目標蛋白對報告蛋白結(jié)構(gòu)和功能的干擾。通過剪接恢復氨基糖苷類抗性基因(KanR)的功能,使剪接活性與細胞存活直接相關,便于通過生長曲線評估蛋白穩(wěn)定性。
 
  具體而言,該方法利用內(nèi)含肽在特定條件下自發(fā)剪接的特性,將目標蛋白的穩(wěn)定性與剪接效率直接掛鉤,實現(xiàn)體內(nèi)蛋白穩(wěn)定性的定量評估。當目標蛋白穩(wěn)定時,內(nèi)含肽剪接效率高,KanR功能恢復,細胞在含抗生素的培養(yǎng)基中存活;反之,當目標蛋白不穩(wěn)定時,內(nèi)含肽剪接效率低,KanR功能無法恢復,細胞死亡。通過監(jiān)測細胞存活率,可以間接評估目標蛋白的穩(wěn)定性。
 
  高通量分析的實現(xiàn)
 
  該方法具有高通量分析的潛力。通過將不同突變體或不同處理條件下的細胞分別培養(yǎng)在微孔板中,可以同時監(jiān)測多個樣本的蛋白穩(wěn)定性。此外,結(jié)合自動化液體處理系統(tǒng)和高通量測序技術,可以進一步提高分析通量。
 
  應用前景
 
  基于內(nèi)含肽的生物傳感器在蛋白穩(wěn)定性監(jiān)測中具有廣泛的應用前景:
 
  快速評估突變對蛋白穩(wěn)定性的影響:通過將突變體插入內(nèi)含肽內(nèi)部,可以快速篩選出影響蛋白穩(wěn)定性的關鍵突變。
 
  藥物篩選:通過監(jiān)測藥物處理后蛋白穩(wěn)定性的變化,可以評估藥物對蛋白功能的影響,為藥物研發(fā)提供重要依據(jù)。
 
  伴侶蛋白表達優(yōu)化:通過監(jiān)測伴侶蛋白表達對目標蛋白穩(wěn)定性的影響,可以優(yōu)化伴侶蛋白的表達條件,提高重組蛋白的生產(chǎn)效率。
 
  小分子化合物篩選:通過識別影響蛋白穩(wěn)定性或剪接反應的小分子化合物,可以探索其作用機制,為新藥研發(fā)提供候選化合物。
 
  結(jié)論
 
  基于內(nèi)含肽的生物傳感器為活細胞內(nèi)蛋白穩(wěn)定性的實時監(jiān)測提供了一種新范式。該方法具有操作簡便、高通量、定量準確等優(yōu)點,在蛋白穩(wěn)定性研究、藥物篩選和重組蛋白生產(chǎn)等領域具有廣泛的應用前景。隨著技術的不斷發(fā)展,基于內(nèi)含肽的生物傳感器有望在生命科學研究和生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中發(fā)揮更大的作用。
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